Този първи случай на генетична манипулация в гущер създаде моделен организъм, който би могъл да помогне за по-нататъшно разбиране на еволюцията и развитието на влечугите
CRISPR-Cas9 или просто CRISPR е уникален, бърз и евтин инструмент за редактиране на гени , който позволява редактиране на геном чрез изтриване, добавяне или промяна на ДНК . CRISPR е акроним, който означава „Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats“ (клъстерирани редовно разположени палиндромни повторения). Този инструмент е прост и по-прецизен от предишните методи, използвани за редактиране на ДНК.
Инструментът CRISPR-Cas9 инжектира организми на етап зигота (една клетка) с ДНК конструкция, направена от (а) ензим Cas9, който действа като „ножица“ и може да отреже или изтрие част от ДНК, (б) насочваща РНК – последователност, която съответства на целевия ген и по този начин насочва ензима Cas9 към целевото място. След като целевият участък от ДНК бъде отрязан, механизмът за поправка на ДНК на клетката ще се присъедини отново към останалата верига и по този начин ще заглуши целевия ген. Или генът може да бъде „коригиран“ чрез използване на нов модифициран ДНК шаблон в процес, наречен хомологично насочена поправка. По този начин инструментът CRISPR-Cas9 позволява генетични модификации чрез инжектиране на разтвори за редактиране на гени в оплодена едноклетъчна яйцеклетка. Този процес причинява генетична промяна (мутация) във всички следващи клетки, които се произвеждат, като по този начин засяга функцията на гена.
Въпреки че CRISPR-Cas9 рутинно се използва при много видове, включително риби, птици и бозайници, досега той не е бил успешен при генетично манипулиране на влечуги. Това се дължи преди всичко на две бариери. Първо, женските влечуги съхраняват сперма за дълго време в яйцепровода си, което затруднява определянето на точното време на оплождане. Второ, физиологията на яйцата на влечугите има много характеристики като гъвкави яйчени черупки, крехкост без въздушно пространство вътре, което прави предизвикателство да се манипулират ембрионите, без да се причинява разкъсване или увреждане.
В статия, качена в bioRxiv на 31 март 2019 г., изследователи съобщават за разработването и тестването на начин за използване на генно редактиране CRISPR-Cas9 при влечуги за първи път. Избраният вид влечуго в изследването е тропически гущер , наречен Anolis sagrei или по-често кафяв анол, който е широко разпространен в Карибите. Гущерите в изследването са събрани от див район във Флорида, САЩ. Този вид е идеално подходящ за изследването поради миниатюрния си размер, дългия размножителен период и относително краткото средно време между две поколения.
За да се преодолеят ограниченията, пред които са изправени понастоящем влечугите, изследователите микроинжектират компоненти на CRISPR в незрели неоплодени яйца, докато яйцата все още са били в яйчниците на женски гущери преди оплождането. Те се насочиха към гена на тирозиназа, който произвежда ензим, който контролира пигментацията на кожата при гущерите и ако този ген бъде премахнат, гущерът ще се роди албинос. Този ясен фенотип на пигментацията беше причината да се избере ген на тирозиназа. След това микроинжектираните яйцеклетки узряват вътре в женската и впоследствие се оплождат естествено с въведена мъжка или съхранявана сперма.
В резултат на това, няколко седмици по-късно се родиха четири албиносови гущера, потвърждавайки, че генът тирозиназа е деактивиран и процесът на редактиране на гени е бил успешен. Тъй като потомството съдържаше редактиран ген и от двамата родители, беше ясно, че компонентите на CRISPR остават активни много по-дълго в незрелия ооцит на майката и след оплождането мутираха бащините гени. По този начин, мутиралите албиносови гущери проявиха манипулирана тирозиназа в гени, наследени както от майката, така и от бащата, тъй като албинизмът е черта, наследена и от двамата родители.
Това е първото изследване за ефективно производство на генетично модифицирани влечуги. Изследването може да работи по подобен начин при други видове гущери като змии, за които настоящите подходи досега са били неуспешни. Тази работа може да помогне за по-нататъшно разбиране на еволюцията и развитието на влечугите.
***
Източник (и)
Rasys AM et al. 2019. Предпечат. Редактиране на гени CRISPR-Cas9 при гущери чрез микроинжектиране на неоплодени ооцити. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
***
