Този първи случай на генетична манипулация в гущер създаде моделен организъм, който би могъл да помогне за по-нататъшно разбиране на еволюцията и развитието на влечугите
CRISPR-Cas9 или просто CRISPR е уникален, бърз и евтин ген инструмент за редактиране, който позволява редактиране на геном чрез изтриване, добавяне или промяна ДНК. Съкращението на CRISPR е съкращение от „групирани редовно между разстояния палиндромни повторения“. Този инструмент е прост и по-прецизен от предишните методи, използвани за редактиране ДНК.
Инструментът CRISPR-Cas9 инжектира организми на етап зигота (едноклетъчен) с ДНК конструкция, направена от (а) ензим Cas9, който действа като „ножица“ и може да отреже или изтрие част от ДНК, (б) направляваща РНК – последователност, която съответства на целевия ген и по този начин насочва ензима Cas9 до целевото място. След като целевата част от ДНК бъде отрязана, машината за възстановяване на ДНК на клетката ще се присъедини отново към останалата верига и в процеса ще заглуши целевия ген. Или генът може да бъде „коригиран“ чрез използване на нов модифициран ДНК шаблон в процес, наречен хомологично насочен ремонт. По този начин инструментът CRISPR-Cas9 позволява генетични модификации чрез инжектиране редактиране на гени разтвори в едноклетъчно оплодено яйце. Този процес причинява генетична промяна (мутация) във всички следващи клетки, които се произвеждат, като по този начин засягат генната функция.
Въпреки че CRISPR-Cas9 рутинно се използва при много видове, включително риби, птици и бозайници, досега той не е бил успешен при генетично манипулиране на влечуги. Това се дължи преди всичко на две бариери. Първо, женските влечуги съхраняват сперма за дълго време в яйцепровода си, което затруднява определянето на точното време на оплождане. Второ, физиологията на яйцата на влечугите има много характеристики като гъвкави яйчени черупки, крехкост без въздушно пространство вътре, което прави предизвикателство да се манипулират ембрионите, без да се причинява разкъсване или увреждане.
В статия, качена на bioRxiv on March 31, 2019 researchers have reported development and testing of a way to use CRISPR-Cas9 ген редактиране in reptiles for the first time. The reptile species chosen in the study was a tropical гущер нарича Anolis sagrei или по-често кафяв анол, който е широко разпространен в Карибите. Гущерите в изследването са събрани от див регион във Флорида, САЩ. Този вид е идеално подходящ за изследване поради миниатюрния си размер, дългия размножителен период и сравнително краткото средно време между две поколения.
За да се преодолеят ограниченията, пред които са изправени понастоящем влечугите, изследователите микроинжектират компоненти на CRISPR в незрели неоплодени яйца, докато яйцата все още са били в яйчниците на женски гущери преди оплождането. Те се насочиха към гена на тирозиназа, който произвежда ензим, който контролира пигментацията на кожата при гущерите и ако този ген бъде премахнат, гущерът ще се роди албинос. Този ясен фенотип на пигментацията беше причината да се избере ген на тирозиназа. След това микроинжектираните яйцеклетки узряват вътре в женската и впоследствие се оплождат естествено с въведена мъжка или съхранявана сперма.
As a result, four albino lizards were born few weeks later confirming that gene tyrosinase was deactivated and the ген редактиране process was successful. Since the offspring contained edited gene from both parents it was clear that CRISPR components remained active much longer in mother’s immature oocyte and post fertilization it mutated paternal genes. Thus, mutant albino lizards exhibited manipulated tyrosinase in genes inherited from both mother and father as albinism is a trait inherited from both parents.
Това е първото изследване за ефективно производство на генетично модифицирани влечуги. Изследването може да работи по подобен начин при други видове гущери като змии, за които настоящите подходи досега са били неуспешни. Тази работа може да помогне за по-нататъшно разбиране на еволюцията и развитието на влечугите.
***
{Това проучване в момента е изпратено за партньорска проверка. Можете да прочетете предпечатната версия, като щракнете върху връзката DOI, дадена по-долу в списъка с цитирани източници}
Източник (и)
Rasys AM et al. 2019. Preprint. CRISPR-Cas9 Редактиране на гени in Lizards Through Microinjection of Unfertilized Oocytes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
